Karakteristik Fenotipik Isolat Bakteri

Disusun oleh Marlin M. Raunsai

Universitas Negeri Yogyakarta, 2011-11-20

A.    Tinjauan Pustaka

Karakteristik fenotipik isolat bakteri dapat diketahui adalah melalui pembiakan bakteri dalam laboratorium mikrobiologi. Bakteri memerlukan medium untuk pembiakannya. Medium tersebut berisi zat hara serta faktor lingkungan yang sesuai dengan bakteri. Zat hara tersebut digunakan untuk pertumbuhan, sintesis sel, keperluan energi dalam metabolisme, dan pergerakannya. Medium tersebut harus mengandung air, sumber karbon, sumber energi, fosfat, oksigen, nitrogen, sulfur, dan lain-lain.

Medium tidak hanya merupakan sumber makanan bagi bakteri tetapi juga mendukung sejumlah fungsi khusus lainnya yaitu isolasi bakteri dari mikroorganisme campuran, memisahkan kelompok bakteri berdasarkan kenampakan makroskopis koloni dan reaksi fisiologis (biokimiawi) dalam medium, untuk perhitungan jumlah bakteri, uji zat-zat yang disintesa secara alamiah, serta karakterisasi dan identifikasi bakteri melalui kemampuannya menghasilkan perubahan-perubahan kimiawi pada medium yang berbeda.

Media pertumbuhan berdasarkan konsistensinya terbagi menjadi tiga yaitu media padat, media semisolid, dan media cair. Penjelasannya adalah sebagai berikut:

1.      Media padat

Media padat yaitu media yang didapatkan dengan menambahkan bahan pemadat seperti agar, gelatin, atau silika gel ke dalam media cair. Pada praktikum mikrobiologi biasanya menggunakan agar (kompleks polisakarida terdiri dari galaktosa dan asam galakturonat) yang merupakan ekstrak red marine algae. Agar ditambahkan ke media dengan konsentrasi 1,5-2,0% (w/v), supaya dihasilkan media yang benar-benar padat. Bentuk media agar adalah agar tegak (kebutuhan mikroorganisme akan oksigen), agar miring (menyimpan kultur murni mikroorganisme), dan agar plate (karakteristik permukaan koloni bakteri sebagai tahap awal identifikasi).

2.      Media semisolid

Konsistensi media semisolid antara media cair dan media padat. Agen pemadat yang ditambahkan kurang dari 1 % sehingga media ini seperti jelly. Umumnya digunakan untuk menguji motilitas bakteri.

3.      Media cair

Media cair hanya mengandung komponen-komponen yang dilarutkan dalam aquadest dan tidak mengandung bahan pemadat. Umumnya media ini digunakan untuk propagasi mikroorganisme, uji fermentasi, dan berbagai uji lainnya.

Karakteristik fenotipik isolat bakteri yang perlu diamati dan diuji adalah morfologi koloni, morfologi sel, sifat fisiologis biokimiawi, dan pengaruh faktor lingkungan. Morfologi koloni dapat ditelusuri dalam Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Morfologi sel dapat melalui 2 cara yaitu mengamati sel hidup yang tidak di cat dan mengamati sel bakteri mati yang sudah di cat. Sifat fisiologis biokimiawi dilakukan melalui uji fermentatif dan hidrolisis. Faktor lingkungan yang perlu diperhatikan adalah suhu, pH, aerasi yang harus benar-benar dikontrol (Geo F. Brooks. 2005).

B.     Tujuan

1.      Mengembangkan kemampuan mahasiswa dalam mendeskripsikan kenampakan makroskopis (cultural characteristic) isolat bakteri uji pada berbagai media.

2.      Mengembangkan kemampuan mahasiwa dalam mendeskripsikan karakteristik fisiologis biokimiawi isolat bakteri uji pada berbagai media (fermentasi, hidrolitik, dan lain-lain).

C.     Cara Kerja

Pengecatan Gram:

1.      Gelas benda dibersihkan dengan alkohol kemudian dilewatkan beberapa kali diatas nyala api bunsen hingga kering dan bebas lemak/minyak.

2.      Olesan tipis bakteri dibuat pada gelas benda tersebut. Olesan dibuat dengan cara: satu/dua ose aquadest steril diletakkan dibagian tengah gelas benda tadi, kemudian isolat bakteri uji diambil secara aseptik dan disuspensikan dengan tetesan aquadest. Kering anginkan dan difiksasi dengan melewatkan beberapa kali diatas nyala api bunsen.

3.      Olesan tersebut dibubuhi secara merata dengan kristal violet (Gram A, cat primer) dan dibiarkan 30 detik kemudian dicuci dengan air mengalir hingga tetesan airnya jernih kemudian dikeringanginkan.

4.      Larutan iodin (Gram B, larutan mordan) dibubuhi merata pada olesan tersebut dan dibiarkan selama 30 detik kemudian dicuci pada air mengalir hingga tetesan air jernih dan dikering anginkan.

5.      dekolorisasi dilakukan dengan membubuhi olesan tersebut dengan etil alkohol 95% selama 10 – 20 detik. Kemudian dicuci dengan air selama beberapa detik untuk menghentikan aktivitas dekolorisasi.

6.      Olesan tadi dibubuhi lagi dengan safranin (Gram D) selama 20 – 30 detik. Kemudian dicuci dengan air mengalir untuk membersihkan semua sisa cat, selanjutnya air dihisap dengan kertas penghisap dan dikering anginkan.

7.      Hasil pengecatan diamati melalui mikroskop.

8.      Bakteri gram positif berwarna ungu/biru dan bakteri gram negatif berwarna merah muda.

Pengujian dengan pengamatan kultural karakteristik:

1.      Nutrien agar plate: Isolat bakteri diinokulasikan dengan metode titik pada satu dan dengan metode garis lurus tempat dipermukaan agar plate.

2.      Nutien agar slant: Isolat bakteri diinokulasikan dengan jarum ose dengan metode zig zag dari ujung hingga pangkal.

3.      Nutrien agar tegak: Isolat bakteri diinokulasikan dengan jarum ose. Satu tusukan lurus dibentuk di tengah medium mulai dari pangkal sampai ujungnya.

4.      Nutrien cair: Isolat bakteri diinokulasikan dengan jarum ose kolong dan digerakkan beberapa kali pada medium nutrien cair agar isolat bakteri terlepas dari ose.

5.      Semua kultur diinokulasikan pada suhu kamar selama 24-48 jam.

6.      Pengamatan disesuaikan dengan gambar karakteristik kultur pada lampiran 4.

Pengujian daya fermentatif dan hidrolitik

Fermentasi karbohidrat

1.      Dengan teknik aseptik, isolat bakteri X diinokulasikan ke media glukosa cair dan sukrosa cair.

2.      semua tabung diinkubasi selama 24-48 jam pada temperatur kamar.

3.      Perubahan-perubahan diamati dan dicatat.

Hidrolisa pati

1.      Dengan teknik aseptik, inokulasi goresan garis lurus isolat bakteri X dibuat pada medium pati agar. Diinkubasi terbalik selama 24-48 jam pada temperatur kamar.

2.      Daya hidrolitik: Goresan isolat bakteri ditetesi dengan larutan iod dan dibiarkan 30 detik.

3.      Hasil diamati yaitu terbentuknya zona jernih disekitar koloni.

Uji katalase

1.      Gelas benda dibersihkan dengan alkohol dan dikeringkan diatas nyala api bunsen.

2.      Isolat bakteri X diambil secara aseptis dengan jarum ose dan dioleskan pada gelas benda.

3.      Olesan bakteri tersebut ditetesi dengan 3 % hidrogen peroksida.

4.      Apabila bakteri dapat menghidrolisis hidrogen peroksida maka akan timbul gelembung.

D.    Pembahasan

Pada praktikum mikrobiologi yang diadakan pada hari senin, oktober 2011. Diperoleh hasil pengamatan pengecatan gram adalah sebagai berikut.

Gram A (Kristal violet)     : Ungu

Gram B (Iod)                                : Ungu

Gram C (Alkohol)             : Putih

Gram D (Safranin)                        : Merah muda

Berdasarkan hasil yang diperoleh, bakteri ini dinyatakan sebagai bakteri gram negatif. Dari hasil tersebut dapat dijelaskan prosesnya sebagai berikut.

Cat gram A mengandung kristal violet (cat primer) sehingga berwarna ungu pada bakteri. Cat gram B berfungsi memfiksasi cat primer pada bakteri X sehingga pengikatan warna lebih kuat sehingga bakteri tetap berwarna ungu. Cat gram C berfungsi melunturkan cat sebelumnya dan bakteri X tersebut mengalami dekolorisasi dan tidak berwarna sehingga dinyatakan sebagai bakteri gram negatif. Menurut teori, hal ini kemungkinan diakibatkan oleh dinding sel bakteri gram negatif memiliki kadar lipid yang tinggi (20%) sehingga mudah larut dengan alkohol mengakibatkan pori-pori dinding sel membesar menyebabkan zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna. Teori lain mengatakan bahwa kemungkinan bakteri tersebut mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis hanya 1-2 lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak. Sehingga permeabilitas dinding sel lebih besar yang mengakibatkan masih memungkinkan lepasnya kompleks kristal yodium.

Olesan bakteri X kemudian dibubuhi oleh cat gram D (safranin) sebagai cat sekunder yang berfungsi memberikan warna pada mikroorganisme non target. Bakteri ini berwarna merah muda karena cat sebelumnya telah luntur sehingga mampu mengikat cat gram D.

Setelah melakukan pewarnaan gram, kemudian praktikan melakukan pengujian untuk pengamatan kultural karakteristik. Berikut tabelnya.

           

No	Medium	Pengamatan pada
		24 jam	48 jam
1.	Nutrien Agar (NA) tegak	Motil	Motil
2.	SIM	Motil	Motil
3.	Nutrien cair (NB)	Warna merah muda di permukaan medium	Warna merah muda di permukaan medium
4.	Glukosa	Merah muda	Gelembung pada tabung burdam
5.	Sukrosa	Merah muda	Gelembung pada tabung burdam
6.	Pati agar	Negatif
7.	Nutrien Agar (NA) plate		Negatif
8.	CMC		Negatif
9.	Simon sitrat	Motil	Motil
10.	Uji katalase	Positif

            Berdasarkan tabel diatas, pada NA tegak untuk pengamatan 24 jam dan 48 jam bahwa bakteri X tersebut motil.